«Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» icon

«Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»



Смотрите также:




На правах рукописи




БИКТАСОВА

Асель Кинжибулатовна


РОЛЬ БЕЛКОВ-РЕГУЛЯТОРОВ

ПРОГРАММИРОВАННОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ В РЕАЛИЗАЦИИ ПРОАПОПТОТИЧЕСКОГО

ЭФФЕКТА ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА НА ЛИМФОЦИТЫ КРОВИ


14.03.03 – патологическая физиология

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук




Новосибирск – 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Томск)


^ Научные руководители:





доктор медицинских наук,

профессор



Рязанцева Наталья Владимировна

доктор медицинских наук


Жукова Оксана Борисовна

^ Официальные оппоненты:





доктор медицинских наук,

профессор



Сафронов Игорь Дмитриевич

доктор медицинских наук


Потапов Алексей Валерьевич


Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биохимии СО РАМН (Новосибирск)


Защита состоится «16» марта 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, 2, Новосибирск, 630117.

Тел/факс 8 (383) 333-64-56


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН


Автореферат разослан «10 » февраля 2010 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета,

д. б. н. Пальчикова Н.А.

^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность исследования. Патогенез многочисленных заболеваний человека (иммунопатологические состояния, злокачественные новообразования, хронические инфекционные процессы и др.) тесно связан с нарушением клеточной гибели. Одной из ведущих причин дизрегуляции танатогенной программы клеток является изменение продукции клетками и/или модуляция биологических эффектов фактора некроза опухоли альфа (tumor necrosis factor α, TNFα) (Bazzoni F., Beutler B., 1996; Aggarwal B.B., 2000; Locksley R.M. et al., 2001; Joussen A.M. et al., 2009). В физиологических условиях TNFα участвует в эмбриогенезе, развитии разнообразных тканей, при патологии – играет ведущую роль в формировании воспалительных реакций и специфического иммунного ответа (Ройт А., 2000; MacEwan D.J., 2002; Хаитов Р.М., 2006; Кулинский В.И., 2007). Действие TNFα на клетки-мишени осуществляется за счет связывания со своими высокоаффинными рецепторами, расположенными на плазматической мембране, что ведет к интрацеллюлярным реакциям, находящим свое отражение в изменении их функционального статуса, в том числе и посредством инициации клеточной гибели (MacEwan D.J., 2002; Gupta S. et al., 2005).

К настоящему времени выявлена способность TNFα инициировать как апоптотическую гибель клеток, опосредованную повышенной секрецией данного цитокина при воспалительных заболеваниях аутоиммунного и инфекционного генеза, так и некроз клеток паренхиматозных органов в условиях гиперпродукции TNFα при септических состояниях. При этом характер и интенсивность процесса гибели клеток определяется количеством воздействующего на них TNFα, что дает основание предположить дозозависимость влияния цитокина на реализацию танатогенной программы. (Faraco P.R. et al., 1999; Van den Berg W.B., 2001; Van Amersfoort E.S. et al., 2003; Lin Y. et al., 2004; Temkin V. et al., 2006; He S. et al., 2009). Однако экспериментальные факты, свидетельствующие в пользу указанного предположения, немногочисленны, что обуславливает целесообразность изучения действия различных концентраций рекомбинантного TNFα на инициацию того или иного вида TNFα-опосредованной клеточной гибели.

Накопленные к настоящему времени сведения о TNFα-зависимых механизмах запуска летальной программы достаточно детально, по сравнению с другими видами цитокиноопосредованного апоптоза, описывают события, происходящие в клетке при реализации TNFα-индуцированной апоптотической гибели. Однако вследствие использования исследователями разных клеточных моделей и экспериментальных условий возникают серьезные трудности в интеграции многочисленных разрозненных фактических результатов, касающихся указанной проблемы (Webster G.A., Perkins N.D., 1999; Fridman J.S., Lowe S.W., 2003; Liu B. et al., 2008). Особенно остро данный вопрос стоит в отношении механизмов мобилизации заключенных в межмембранном митохондриальном пространстве апоптогенных факторов, находящейся под контролем белков семейства Bcl-2 (Jiang P. et al., 2006; Chen X. et al., 2007).

Образование и/или деградация анти- и проапоптотических членов семейства протеинов Bcl-2 регулируется транскрипционными факторами, в том числе NF-kB и Р53. Вовлеченность NF-kB и Р53, а также представителей семейства белков Bcl-2 в реализацию TNFα-индуцированной апоптотической гибели не вызывает сомнений. Однако отсутствие единой точки зрения о характере заинтересованности данных регуляторных молекул в TNFα-опосредованный апоптоз делает целесообразным проведение комплексного исследования указанных протеинов при действии на клетки рекомбинантного цитокина и при патологии, сопровождающейся повышенной продукцией лимфоцитами TNFα. Полученные знания могут быть положены в основу разработки технологии коррекции патологических процессов и состояний, характеризующихся изменением продукции и рецепции TNFα, а также модуляцией его внутриклеточной сигналпередающей системы.

^ Цель исследования: установить роль белков-регуляторов программированной клеточной гибели (белки семейства Bcl-2 и факторы транскрипции) в регуляции апоптоза лимфоцитов крови при действии фактора некроза опухоли альфа.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

  1. Установить дозозависимость влияния фактора некроза опухоли альфа на реализацию апоптоза и некроза лимфоцитов крови in vitro.

  2. Оценить причастность митохондриального пути (количество лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, внутриклеточный уровень активных форм кислорода) к регуляции апоптоза лимфоцитов крови, индуцированного фактором некроза опухоли альфа.

  3. Определить содержание белков-регуляторов клеточной гибели (транскрипционные факторы NF-kB и Р53, ингибитор циклинзависимых киназ P21WAF1/Cip1, протеины семейства Bcl-2) в лимфоцитах крови, полученных у здоровых доноров, при действии рекомбинантного фактора некроза опухоли альфа и у пациентов с острым клещевым энцефалитом, характеризующимся измененной продукцией фактора некроза опухоли альфа.

  4. Выявить общие закономерности и особенности влияния фактора некроза опухоли альфа на апоптоз лимфоцитов крови в условиях in vitro и при остром клещевом энцефалите.

Научная новизна. Впервые в условиях in vitro установлено, что рекомбинантный TNFα человека дозозависимо влияет на реализацию апоптотической и некротической гибели лимфоцитов крови. Получены новые данные о регулирующей роли транскрипционных факторов NF-kB и Р53, а также о характере изменения баланса белков семейства Bcl-2 при реализации апоптоза иммунокомпетентных клеток, индуцированного TNFα. Установлено, что при инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита, на фоне повышенного образования TNFα апоптоз лимфоцитов крови реализуется при участии митохондрий, активных форм кислорода и сопряжен с активацией транскрипционных факторов, а также с нарушением соотношения про- и антиапоптотических Bcl-2-белков. Установлено, что дизрегуляция апоптоза лимфоцитов крови как при действии рекомбинантного TNFα in vitro в дозе 0,050 нг/мл, так и при остром клещевом энцефалите, сопровождающемся повышенной продукцией данного цитокина, обусловлена запуском однотипных молекулярных механизмов реализации апоптотической гибели.

^ Теоретическая и практическая значимость. Полученные в ходе проведенного исследования фактические данные носят фундаментальный характер и раскрывают молекулярные механизмы участия транскрипционных факторов (NF-kB и Р53) и белков семейства Bcl-2 в TNFα-опосредованной регуляции программированной гибели лимфоцитов в условиях in vitro с применением рекомбинантной формы цитокина. Установлена роль данных участников внутриклеточного сигналинга в дизрегуляции апоптоза иммунокомпетентных клеток при инфекционной патологии, сопровождающейся повышенной продукцией TNFα. Результаты настоящего исследования в дальнейшем могут способствовать раскрытию механизмов побочных эффектов анти-TNFα-направленной терапии, а также послужить основой для разработки новых технологий коррекции нарушений программы клеточной гибели при заболеваниях, характеризующихся изменением продукции данного цитокина.

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедр патофизиологии (разделы «Патофизиология иммунной системы», «Патофизиология клетки»), фундаментальных основ клинической медицины (разделы «Клиническая патофизиология реактивности организма», «Молекулярные основы патологии»), кафедры морфологии и общей патологии (разделы «Основы цитофизиологии; старение, гибель клетки, взаимодействие клетки с окружающей средой», «Инфекционный процесс: острые инфекции») ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

^ Положения, выносимые на защиту:

  1. Рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека оказывает прямой регулирующий эффект на реализацию апоптоза и некроза лимфоцитов крови.

  2. В условиях инфекционного процесса, сопровождающегося повышенной продукцией фактора некроза опухоли альфа (на примере клещевого энцефалита), и при культивировании клеток с рекомбинантным фактором некроза опухоли альфа регуляция апоптоза лимфоцитов крови осуществляется посредством молекулярных механизмов, связанных с активацией митохондриального пути, участием активных форм кислорода и транскрипционных факторов (NF-kB и P53), а также изменением соотношения про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2.

^ Апробация диссертации. Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на VIII Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций» (Кемерово, 2008), ХIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2008), VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), Х Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2009).

Исследования выполнены в рамках проектов РФФИ – «Молекулярные механизмы управления программированной гибелью клеток с использованием регуляторных молекул» (№ 07-04-12150_офи), «Разработка способов направленной коррекции дизрегуляции пролиферации и апоптоза нормальных и патологически измененных клеток с помощью регуляторных молекул» (09-04-99025-р_офи), а также в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (проект «Разработка технологических основ персонализированной терапии и профилактики социально-значимых бактериальных и вирусных заболеваний на основе идентификации молекулярно-генетических механизмов нарушений иммунореактивности системы крови», государственный контракт № 02.512.12.0013 от 01.08.2008 г.), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме: «Разработка технологической платформы молекулярной диагностики и лечения социально значимых заболеваний и подготовка на ее основе научно-исследовательских кадров для молекулярной медицины» (государственный контракт № 02.740.11.0311 от 07.07.2009 г.), поддержаны грантом Совета при Президенте РФ (государственный контракт № 02.120.11.3842-МД от 24.09.2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из них – 3 статьи в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования), выводов и списка цитированной литературы, включающего 258 источников, из них - 42 отечественных и 216 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 13 рисунками.


^ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО И КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ


Для достижения поставленной цели в диссертационной работе были выделены два блока исследования: экспериментальный и клинический.

На первом этапе в условиях культивирования лимфоцитов здоровых доноров с рекомбинантным TNFα (rTNFα) в диапазоне концентраций от 0,015 до 0,150 нг/мл была проведена оценка дозозависимого влияния rTNFα на вовлеченность указанных клеток в апоптоз и некроз, идентифицирована заинтересованность в реализации TNFα-опосредованной апоптотической гибели активных форм кислорода, пермеабилизации митохондрий, транскрипционных факторов, белков семейства Bcl-2. На втором этапе была проведена проверка гипотезы об участии данных факторов в дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при клещевом энцефалите, сопровождавшегося изменением продукции цитокина.

В основу работы положены результаты комплексного обследования 65-ти человек (30 мужчин и 35 женщин, средний возраст 31±3 года). Из них 20 здоровых доноров и 45 пациентов с клещевым энцефалитом (КЭ), включая 25 лиц с острым клещевым энцефалитом (ОКЭ) и 20 человек с хронической антигенемией вируса КЭ (более 6 мес. после острого периода КЭ). Критериями исключения из исследования явились: возраст менее 18 или более 50 лет, наличие в анамнезе фактов злоупотребления алкоголем, наркотической зависимости, психических расстройств; обострение хронических соматических заболеваний, наличие инфекционных болезней другой этиологии, период проведения противовирусной, иммуномодулирующей, а также иной фармакотерапии.

Обследованные пациенты находились либо на диспансерном учете, либо на стационарном лечении в неврологическом отделении МЛПУ МСЧ «Строитель» (главный врач – Н.Н. Бартфельд), а также в инфекционном отделении МЛПУ «Городская больница №3» г. Томска (главный врач – М.А. Лукашов). Клинические группы были сформированы при непосредственном участии профессора кафедры неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ра мед. наук, профессора Н.Г. Жуковой. У всех обследованных лиц было получено добровольное информированное согласие на проведение необходимых для исследования манипуляций.

Материалом исследования являлась кровь, взятая утром натощак путем пунктирования локтевой вены и стабилизированная гепарином (25 ЕД/мл).

Исследование проводилось на базе Научно-образовательного центра молекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (руководитель – канд. мед. наук О.Е. Чечина).

Распределение здоровых доноров и пациентов с клещевым энцефалитом в соответствии с использованными методами исследования представлены в таблице 1.

Лимфоциты выделяли в стерильных условиях из цельной венозной крови методом градиентного центрифугирования с использованием Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (ρ=1,077 г/см3). Выделенные лимфоциты крови культивировали в полной питательной среде, состоящей из 90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Sigma Aldrich», США), 0,3 мг/мл L-глутамина и 2мМ/мл НЕРЕS («F1оw», GВ), в течение 18 ч при 37ºC и 5% СО2 (Хаитов Р.М. и др., 1995). При проведении экспериментального блока в инкубационную среду добавляли соответствующее количество рекомбинантного TNFα человека (rTNFα) в конечной концентрации 0,015; 0,025; 0,050; 0,100 и 0,150 нг/мл («Biosource», США).

Количество клеток в состоянии апоптоза и некроза оценивали с помощью FITC-меченного аннексина V и пропидий йодида («Beckman Coulter», Франция) на проточном цитофлюориметре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) (Pepper A. et al., 1998). Относительное число лимфоцитов со сниженным мембранным митохондриальным потенциалом определяли с использованием набора реагентов «MitoScreen» («BD Pharmigen», США). Уровень АФК в клетках оценивали с использованием красителя с заблокированной флюоресценцией – дихлорфлюоресцеина диацетата («Sigma Aldrich», США). Число лимфоцитов, презентирующих на своей поверхности TNF-RI (CD120), определяли с помощью стандартных моноклональных антител к TNF-RI, меченных фикоэритрином («R&D», США).

Продукцию лимфоцитами крови TNFα оценивали путем твердофазного иммуноферментного анализа по инструкции, предлагаемой фирмой-производителем тест-систем («Procon», Россия).

Для определения содержания транскрипционных факторов (NF-kB, p53) и белков-регуляторов апоптоза (Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad) был использован метод вестерн-блоттинга. Образцы для анализа получали путем лизирования клеток. Белки разделяли по молекулярной массе методом электрофореза в SDS-полиакриламидном геле – 5%-ом концентрирующем (0,13 мМ Tris-HCl, pH=6,8) и 10%-ом разделяющем (375 мМ Tris-HCl, pH=8,8) под действием электрического поля (10 В/см пути). Далее белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США) в течение 80-90 мин при силе тока 50-60 мА на дорожку. Нитроцеллюлозную мембрану инкубировали с первичными антителами к NF-kB RelA (р65), нефосфорилированному P53, P21WAF1/Cip1, Bax, Bad, Bcl-2 и Bcl-xL («Sigma-Aldrich», США) в разведении 1:300, визуализировали зоны с помощью прицепитирующего субстрата пероксидазы на основе ТМБ (НПО «БиоТест Системы», Москва). Полученные блоты сканировали, изображение обрабатывали с помощью программного обеспечения («Carl Zeiss», Германия).

Таблица 1

^ Распределение здоровых доноров и пациентов в соответствии с использованными методами исследования



Методы исследования

Условия исследования

Инкубирование лимфоцитов здоровых доноров крови с рекомбинантным TNFα в дозах 0,015; 0,025; 0,050; 0,100 и 0,150 нг/мл

Оценка TNFα-опосредованного апоптоза у больных клещевым энцефалитом

Здоровые доноры

Больные острым клещевым энцефалитом

Пациенты с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита

Оценка апоптоза лимфоцитов крови с использованием FITC-меченного аннексина V и пропидия иодида с использованием метода проточной лазерной цитометрии

15

15

25

20

Определение количества лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий с использованием метода проточной лазерной цитометрии

12

12

16

17

Оценка концентрации TNFα в супернатантах лимфоцитов крови in vitro методом иммуноферментного анализа

Не проводилось

14

17

15

Определение количества лимфоцитов крови, несущих на поверхности TNF-RI-рецепторы, методом проточной лазерной цитометрии

Не проводилось

20

18

15

Исследование содержания активных форм кислорода в лимфоцитах крови с использованием метода проточной лазерной цитометрии

12

12

22

17

Определение содержания в лимфоцитах крови

NF-kB, p53, p21, Bcl-2, Bcl-xL, Bax, Bad с использованием метода вестерн-блоттинга

12

12

12

12



Вывод о содержании исследуемого белка в клетке делали по отношению величины сигнала метки искомого белка к величине сигнала с белка нагрузки – фермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа («Chemicon», США).

Результаты исследования были оценены с использованием методов статистического анализа. Характер закона распределения количественных показателей определяли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Для каждой выборки вычисляли следующие характеристики: медиану (Me), 25% и 75% квартили (Q1-Q3). Для проверки гипотезы о значимости межгрупповых различий исследованных признаков был применен критерий Манна-Уитни (U-тест). Для выявления функциональных взаимосвязей между группами изученных параметров вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена. При проверке статистических гипотез вероятность ошибочного принятия неверной гипотезы (p) не превышала 0,05 (5%) (Лакин Г.Ф., 1980; Гланц С., 1998).


^ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ


В ходе эволюции в организме была сформирована сложнейшая многоуровневая система поддержания постоянства внутренней среды, одним из значимых механизмов которой является клеточная гибель путем апоптоза, направленная на устранение избыточных и/или аномальных клеток, а также необходимая для нормального эмбриогенеза (Белушкина Н.Н., Северин С.Е., 2001; Потапнев М.П., 2002; Фильченков А.А., 2003). Большой интерес исследователей в области молекулярной биологии привлекают механизмы цитокиновой регуляции клеточной гибели. Особое положение в ряду цитокинов занимает фактор некроза опухоли альфа (TNFα). TNFα отличается чрезвычайно широким спектром выполняемых функций и обладает собственным каскадом проведения внутриклеточного сигнала, отличным от других цитокинов. По отношению к апоптозу TNFα является мощнейшим стимулятором его рецепторного пути. Однако, несмотря на пристальное изучение в последнее десятилетие апоптоза клеток, опосредованного TNFα, все же остаются открытыми вопросы, касающиеся участия данного цитокина в активации иных механизмов реализации танатогенной программы, связанных с транскрипционными факторами и белками семейства Bcl-2 (MacEwan D.J., 2002). Кроме того, вследствие своей высокой биологической значимости система TNFα и его рецепторов, а также инициируемый ими внутриклеточный сигналинг зачастую становятся мишенью действия болезнетворных агентов (Железникова Г.Ф., 2005; 2006). Все вышесказанное и определило наш интерес к исследованию TNFα-индуцированного апоптоза лимфоцитов и молекулярных путей его модуляции.

Для решения поставленных задач по уточнению молекулярных механизмов проапоптотического эффекта TNFα на лимфоциты крови была использована рекомбинантная форма данного цитокина. Рекомбинантный TNFα (rTNFα) обладает высокой степенью аффинности к рецепторам эндогенного TNFα I (TNF-RI) и II типа (TNF-RII). Связывание rTNFα с TNF-RI и TNF-RII ведет к тримеризации последних с последующим запуском внутри клетки биохимических превращений, идентичных индуцируемым эндогенным TNFα. Одним из проявлений данных интрацеллюлярных событий является реализация танатогенной программы (MacEwan D.J., 2002).

Фундаментальные и клинические исследования указывают на уникальную способность TNFα инициировать и апоптотическую гибель клеток, наблюдаемую при повышенной секреции данного цитокина, сопровождающей воспалительные заболевания аутоиммунного и инфекционного генеза, и некроз клеток паренхиматозных органов в условиях гиперпродукции TNFα при септических состояниях (Van den Berg W.B., 2001; Van Amersfoort E.S. et al., 2003).

Исследование лимфоцитов здоровых доноров, инкубированных в питательной среде, содержащей rTNFα в диапазоне конечных концентраций от 0,015 нг/мл до 0,150 нг/мл, выявило закономерность «доза–эффект» в проявлении того или иного вида клеточной гибели (рис. 1). Добавление в инкубационную среду rTNFα в конечной концентрации 0,015 нг/мл и 0,025 нг/мл не приводило к каким-либо значимым изменениям относительного количества клеток, вовлеченных в процессы апоптоза и некроза. Возможно, что данные дозы rTNFα недостаточны для возникновения необходимого количества эффективных столкновений лиганда и рецептора, лимитированных концентрацией участников реакции в единице объема и способствующих их взаимодействию (Бауков Ю.И., Тюкавкина Н.А., 2008). Однако при дальнейшем повышении концентрации rTNFα в культуральной среде до 0,050 нг/мл и 0,100 нг/мл происходило достоверное увеличение численности аннексинположительных лимфоцитов (р<0,05) по сравнению с интактной культурой, причем доля некротизированных клеток существенно не отличалась от их количества в интактной культуре (р>0,05) (рис. 1).

Рекомбинантный TNFα в концентрации 0,150 нг/мл достоверно повышал по сравнению с интактной культурой относительное содержание лимфоцитов как в состоянии апоптоза, так и подвергшихся некротической гибели (см. рис. 1).

Феномен зависимости реализации того или иного вида клеточной гибели от дозы TNFα, да и цитокинов в целом, малоизучен, и вскрытие его молекулярных основ является предметом отдельного исследования. Анализ результатов проведенного нами эмпирического этапа лишь указывает на факт дозозависимого эффекта влияния rTNFα на танатогенную программу и позволяет заключить, что использование конечной концентрации rTNFα 0,050 нг/мл целесообразно для изучения молекулярных механизмов проапоптотического эффекта цитокина.

*

*

*

*

%

Интактные

клетки


Рис. 1. ^ Изменение количества апоптотических и некротизированных клеток в культуре лимфоцитов крови в зависимости от концентрации рекомбинантного TNFα (rTNFα) в инкубационной среде

Примечание: здесь и на рис. 2, 3

* – р<0,05 по сравнению с аналогичными показателями в интактной культуре лимфоцитов крови


На сегодняшний день установлено, что лиганд-рецепторные взаимодействия с участием TNFα приводят к активации каспазы-8, что инициирует различные пути реализации программы апоптоза, связанные, в том числе, и с формированием пор пермеабилизационного перехода в митохондриальной мембране (Zamzami N. et al., 2000; Zhao Y. et al., 2001; Chen X. et al., 2007). В связи с этим нами была выполнена оценка количества лимфоцитарных клеток с деполяризованной мембраной митохондрий, выявившая увеличение доли лимфоцитов с нарушением целостности митохондриальной мембраны после инкубации с rTNFα в апоптогенной концентрации в 2 раза по сравнению с интактной культурой лимфоцитов (р<0,05) (табл. 2)

Нарушение структуры митохондриальной мембраны совместно с выходом цитохрома С в цитоплазму способствует накоплению АФК (Марри Р. и др., 1993; Бра М. и др., 2005). Возможность реализации данных механизмов повышенной продукции АФК при TNFα-опосредованном апоптозе подтверждается выявленным нами с помощью цитофлуориметрического исследования фактом повышения уровня в лимфоцитах крови, инкубированных с rTNFα в апоптогенной концентрации АФК в 4,4 раза по сравнению с интактными клетками(p<0,05) (см. табл. 2).

АФК совместно с элементами антиоксидантной защиты формируют, так называемое, редокс-состояние клетки, дисбаланс которого может приводить к изменению функционирования различных элементов клеточного сигналинга, активирующихся параллельно с апоптогенным механизмом, опосредованным каспазой-8 и связанным с деятельностью митогенактивируемых протеинкиназ (МАР-киназ) (Guicciardi M.E., Gores G.E., 2003; Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007). МАР-киназы, катализируя реакции фосфорилирования, осуществляют контроль функционирования белковых молекул, и наиболее значимой представляется модуляция образования активных форм ключевых регуляторов апоптоза – различных транскрипционных факторов, таких как Р53 и NF-κB (Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007).


Таблица 2

^ Численность лимфоцитов со сниженным потенциалом мембраны митохондрий и внутриклеточный уровень активных форм кислорода при инкубации клеток с rTNFα в концентрации 0,050 нг/мл (Me (Q1-Q3))


Исследованный показатель

Интактная культура лимфоцитов

Лимфоциты, инкубированные с rTNFα (0,050 нг/мл)

Количество клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, %

2,24(1,34-2,89)


4,54(1,76-6,78)

p<0,05

Уровень активных форм кислорода в клетке, усл. ед.

0,018(0,013-0,019)


0,079(0,076-0,326)

p<0,05


Примечание:

р – достоверность различия показателя по сравнению с таковым в интактной культуре лимфоцитов


Опираясь на вышеописанные теоретические данные о возможной АФК-зависимой заинтересованности факторов транскрипции P53 и NF-κB в реализации апоптоза, мы провели оценку их содержания в лимфоцитах крови, культивированных в среде с rTNFα в апоптогенной дозе. Было установлено, что при инкубировании лимфоцитов в среде, содержащей апоптозиндуцирующую концентрацию rTNFα 0,050 нг/мл, в указанных клетках в 2,1 раза увеличивается количество P65 RelA-субъединицы NF-κB по сравнению с интактными (р<0,05) (рис. 2), что говорит о его TNFα-зависимой активации. Помимо этого, воздействие на лимфоциты крови rTNFα в дозе 0,050 нг/мл приводило к двукратному снижению уровня нефосфорилированной формы белка Р53 (р<0,05) (см. рис. 2).

Существует несколько путей утилизации нефосфорилированного Р53 (Liu B. et al., 2008), поэтому для оценки перехода Р53 в его транскрипционно активное фосфорилированное состояние необходимо было исследовать изменение количества какого-либо белка, ген которого находится под контролем Р53. Предъявляемым требованиям удовлетворяет относящийся к Cip1/Kip1-семейству белков-регуляторов клеточного цикла, протеин Р21WAF1/Cip1 (Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л., 2003; Weiss R.H., 2003), увеличение содержания которого в 1,4 раза было обнаружено в лимфоцитах при действии rTNFα (р<0,05) (см. рис. 2). По всей видимости, зарегистрированное снижение количества нефосфорилированного Р53 в ответ на апоптогенное действие rTNFα является следствием его фосфорилирования.

Таким образом, вышеописанные факты свидетельствует в пользу возможного образования активных форм транскрипционных факторов NF-κB и Р53 при апоптозе клеток, вызванном действием TNFα.

*

*

*

NF-kB

Р53

Р21 WAF1/Cip1

усл. ед.


Рис. 2. Уровень NF-kB, Р53 и Р21WAF1/Cip1 в лимфоцитах крови, культивированных с rTNFα в концентрации 0,050 нг/мл


NF-κB и Р53 опосредуют образование белков семейства Bcl-2, анти- (Bcl-2, Bcl-xL) и проапоптотические (Bax, Bad) члены которого принимают участие в регуляции целостности митохондриальной мембраны (Nouraini S. et al., 2000; Kuwana T. et al., 2005; Parikh N. et al., 2007). Проведенное нами исследование показало, что, по сравнению с интактной культурой, в клетках после культивирования в среде, содержащей rTNFα в конечной концентрации 0,050 нг/мл, уровень Bcl-2-протеина уменьшался практически вдвое (p<0,05), а количество другого антиапоптотического белка – Bcl-xL снижалось на 40% (p<0,05) (рис. 3).


Bcl-2

Bcl-xL

Bax

Bad

*

*

*

*

усл. ед.


Рис. 3. Уровень белков Bcl-2, Bcl-xL, Bax и Bad в лимфоцитах крови, культивированных с rTNFα в концентрации 0,050 нг/мл


На фоне выявленных изменений содержания Bcl-2 и Bcl-xL было также отмечено, что количество промотирующего апоптоз белка Вах в клетках, инкубированных с rTNFα, также снижено почти в 3 раза (p<0,05) (см. рис. 3). При добавлении в инкубационную среду rTNFα уровень в лимфоцитах другого белка с проапоптотическим действием – Bad достоверно увеличивался относительно аналогичного показателя в интактной культуре клеток (p<0,05) (см. рис. 3).

Зарегистрированные нами изменения содержания анти- и проапоптотических белков семейства Bcl-2 способны вызывать образование пор как в наружной мембране митохондрий, так и участвовать в формировании пор пермеабилизационного перехода, что ведет к выходу из межмембранного пространства данных органелл активаторов апоптоза и нарушает работу дыхательной цепи (Фильченков А.А., 2003). Поэтому можно предположить, что рассматриваемые нами белки семейства Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-xL, Bax, Bad) участвуют в TNFα-опосредованной реализации танатогенной программы посредством функционального усиления апоптогенного действия на митохондрии каспазы-8.

Таким образом, подводя итог проведенного экспериментального блока, можно сказать, что TNFα является индуктором апоптотической гибели лимфоцитов и опосредует свое действие не только через рецепторные механизмы, но и через привлечение иных апоптогенных каскадов, связанных с митохондриями, АФК, транскрипционными факторами NF-κB и Р53, а также представителями семейства белков Bcl-2 – Bcl-2, Bcl-xL, Bax и Bad (рис. 4).

Изучение участия данных регуляторов апоптоза, индуцированного TNFα, при заболеваниях, сопровождающихся усилением продукции указанного цитокина, а также проверка гипотезы об их становлении в качестве факторов, способствующих дизрегуляции танатогенной программы, опосредованной TNFα, явилось задачей второго этапа исследования. Для решения поставленной задачи выбор нозологической единицы осуществлялся по следующему критерию – инфекционный процесс должен сопровождаться как с усилением продукции лимфоцитами TNFα, так и с отсутствием изменения наработки лимфоцитарными клетками интересующего нас цитокина.

Данному требованию в полной мере отвечают инфекционные заболевания, вызванные различными лимфотропными вирусами семейства Flaviviridae, в том числе и вирусом клещевого энцефалита (КЭ) (Gritsun T.S. et al., 2003; Жукова Н.Г. и др., 2002; Жукова О.Б., 2006).

Анализ продукции TNFα лимфоцитами крови показал, что у больных, страдающих ОКЭ, продукция цитокина была повышена относительно контрольных значений (р<0,05) (рис. 5а). Исследование продукции TNFα лимфоцитами крови у лиц с хронической антигенемией вируса КЭ не выявило статистически значимых отличий от таковой у здоровых доноров (p>0,05) (см. рис. 5а).




Рис. 4.^ Представления о молекулярных механизмах проапоптотического эффект TNFα (по данным D.J. MacEwan, 2002; J.S. Fridman, S.W. Lowe, 2003; А.А. Фильченков, 2003; J. Kucharczak et al., 2003; S. Gupta et. Al., 2005; P. Jiang et al., 2006 и результатам собственных исследований (выделено цветом))

Примечание: ↑ – повышение; ↓ – снижение



*

*

пг/мл

%

*

*


а б


%

*

*

в

Рис. 5. Концентрация TNFα в супернатантах культур лимфоцитов (а), количество клеток, несущих на своей поверхности TNF-RI-рецепторы, (б) и численность апоптотически измененных лимфоцитов (в) у пациентов с клещевым энцефалитом

Примечание: здесь и на рис. 6 и 7

* – р<0,05 по сравнению с аналогичным показателем у здоровых доноров


Необходимым условием для реализации цитокинопосредованного апоптоза является наличие на плазматической мембране клеток специфических высокоаффинных рецепторов, поэтому с помощью проточной лазерной цитометрии нами был проведен подсчет TNF-RI-положительных лимфоцитов. Данное исследование позволило зафиксировать увеличение доли несущих на своей поверхности TNF-RI лимфоцитарных клеток и у больных ОКЭ, и у пациентов с хронической антигенемией вируса КЭ (рис. 5б).

Биологический смысл выявленных закономерностей, возможно, связан с адаптивной реакцией клеток в ответ на избыток или недостаток продукции TNFα. Указанное предположение может было подтверждено результатами корреляционного анализа. При ОКЭ была выявлена положительная связь между концентрацией цитокина в культуральной жидкости и количеством TNF-RI-позитивных лимфоцитов (r=0,61, р<0,05), а у пациентов с длительным носительством вируса КЭ – отрицательная (r=-0,89, р<0,05).

Далее нами была проведена оценка доли претерпевающих апоптоз лимфоцитов в условиях повышенной продукции TNFα (при ОКЭ), установившая увеличение количества данных клеток более чем в 10 раз (р<0,05) (рис. 5в). Полученные результаты могут являться следствием проапоптотического эффекта цитокина, на что указывает выявленная корреляционная зависимость между количеством TNF-RI-несущих лимфоцитов и процентом клеток в апоптозе (r=0,77, р<0,05).

Установление особенностей поведения внутриклеточных участников TNFα-инициированного апоптоза на клинической модели явилось следующим шагом нашей работы по изучению молекулярных механизмов проапоптотического действия TNFα и путей их модуляции. Первоначально было проверено предположение о заинтересованности митохондрий и АФК в реализации апоптоза лимфоцитов, отмеченного в условиях повышенной продукции TNFα. Нами было установлено, что у больных ОКЭ по сравнению со здоровыми донорами в 3 раза увеличено количество клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий и повышено содержание в лимфоцитах АФК (р<0,05) (табл. 3).

Таблица 3

^ Численность лимфоцитов со сниженным потенциалом мембраны митохондрий и внутриклеточный уровень активных форм кислорода в лимфоцитах крови у пациентов с клещевым энцефалитом (Me (Q1-Q3))


Исследованный показатель

Характеристика обследованных

Здоровые доноры

Больные острым клещевым энцефалитом

Пациенты с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита

Количество лимфоцитов со сниженным

трансмембранным потенциалом

митохондрий, %

2,24(1,34-2,89)


6,74(2,56-10,40) р1<0,05


8,48(7,08-9,06)

р1<0,05

р2>0,05

Уровень

активных форм кислорода в лимфоцитах, усл. ед.

0,018(0,013-0,019)


0,038(0,025-0,055)

р1<0,05


0,015(0,014-0,019)

р1>0,05

р2<0,05


Примечание:

р1 – достоверность различия показателя по сравнению с таковым у здоровых доноров;

р2 – достоверность различия показателя по сравнению с таковым у пациентов с острым клещевым энцефалитом


Выявленные особенности апоптоза при повышенной секреции TNFα могут являться следствием действия различных факторов. В частности, сам цитокин, как ранее обсуждалось, активируя каспазу-8, способствует образованию пор в наружной мембране митохондрий и пор пермеабилизационного перехода, что ведет к нарушению работы дыхательных комплексов и накоплению АФК, опосредуя запуск апоптогенной программы (Фильченков А.А., 2003). Помимо этого, накопление в лимфоцитах АФК при острой вирусной инфекции может быть обусловлено развертыванием острофазной реакции (MacEwan D.J., 2002; Кулинский В.И., 2007). С другой стороны, обнаруженное увеличение в лимфоцитах уровня АФК может быть и нелимфоцитарного происхождения. Показано, что при «респираторном взрыве» в активированных TNFα фагоцитирующих клетках образуется большое количество перекиси водорода, способной проникать в другие клетки крови, в том числе и в лимфоциты, что ведет к запуску танатогенной программы последних (Плетюшкина О.Ю. и др., 2006; Старикова Е.Г., 2008).

Для сравнения нами была проведена оценка количества лимфоцитов с деполяризованной митохондриальной мембраной при хронической антигенемии вируса КЭ, позволившая установить значения данного показателя, сопоставимые с его величинами в культуре лимфоцитов у больных ОКЭ (р>0,05) (см. табл. 3).

Зафиксированные изменения числа клеток с пермеабилизированной митохондриальной мембраной при длительном носительстве антигена вируса КЭ не сопровождались повышением содержания в них АФК (как в лимфоцитах у пациентов с ОКЭ) (см. табл. 3). Отсутствие избыточного количества АФК в лимфоцитах у лиц с длительной персистенцией вируса КЭ, по всей вероятности, обусловлено особенностями продукции цитокинов данными клетками. Известно, что при хронической антигенемии вируса КЭ увеличена продукция IL-4 (Наследникова И.О. и др., 2005), угнетающего синтез мононуклеарами провоспалительных TNFα, IL-1 и IL-12р40, что блокирует образование АФК в фагоцитирующих клетках и снижает их поступление в лимфоциты, с одной стороны (Paludan S.R., 1998; Плетюшкина О.Ю. и др., 2006), а, с другой, – дефицит секреции TNFα способствует ингибированию находящейся под контролем эйкозаноидов генерации АФК (MacEwan D.J., 2002; Кулинский В.И., 2007).

Полученные нами результаты и данные литературы позволяют заключить, что выявленная в условиях гиперсекреции TNFα при ОКЭ пермеабилизация мембраны митохондрий лимфоцитов, по всей видимости, обусловлена как действием на клетки самого цитокина, так и непосредственным воздействием возбудителя вследствие способности флавивирусов к чрезмерной активации каспазы-8, что приводит к запуску TNFα-подобного апоптоза (Prikhod’ko G.G. et al., 2002). Выявленное при острой вирусной нейроинфекции, сопровождающейся повышенной продукцией TNFα, накопление АФК является следствием эффекта цитокина как на лимфоциты, так и на клетки, обладающие фагоцитарной активностью.

Отмеченное при ОКЭ нарушение целостности митохондриальной мембраны и увеличение содержания в лимфоцитах АФК соответствуют найденным в экспериментальном блоке внутриклеточным событиям в ответ на действие рекомбинантной формы TNFα. В связи с этим можно предположить, что в условиях повышенной наработки TNFα лимфоцитами крови реализация апоптотической гибели клеток связана прежде всего с выходом апоптогенных факторов из митохондрий и АФК-зависимой индукцией МАР-киназного каскада с последующей активацией транскрипционных факторов (Webster G.A., Perkins N.D., 1999).

С помощью метода вестерн-блоттинга нами было установлено, что на фоне повышенной продукции лимфоцитами TNFα, сопровождающей ОКЭ, в клетках увеличивается образование свободного транскрипционного фактора NF-κB и снижается содержание нефосфорилированного Р53 (рис. 6). Обнаруженные изменения соответствуют картине экспериментального TNFα-индуцированного апоптоза, что позволяет сделать предположение о существовании связи между продукцией цитокина и активацией NF-κB и Р53.


NF-κB

P53

усл. ед.

*

*

*

Рис. 6. ^ Содержание белков NF-kB и нефосфорилированного Р53 в лимфоцитах крови у пациентов с клещевым энцефалитом


Оценка уровня белков семейства Bcl-2, образование которых находится под контролем NF-κB и Р53, показала, что лимфоциты у пациентов с ОКЭ содержат сниженное количество белков-ингибиторов клеточной гибели Bcl-2 и Bcl-xL в 2 и 4 раза, соответственно (р<0,05) (рис.7), Однако уровень способствующих реализации танатогенной программы Bax и Bad не отличался от такового в лимфоцитах у здоровых доноров (р>0,05) (см. рис. 7).

Обнаруженные различия в содержании указанных выше протеинов имеют неоднозначную интерпретацию. Во-первых, они свидетельствуют о смещении баланса анти- и проапоптотических белков в сторону последних. Преобладание промотирующих апоптоз представителей семейства Bcl-2, по всей вероятности, и определяет формирование пор пермеабилизационного перехода и выход в цитоплазму активаторов апоптоза (Фильченков А.А., 2003). Во-вторых, полученные результаты могут быть в некоторой степени опосредованы внутриклеточным действием инфекта (при хронической антигенемии вируса КЭ зафиксированы аналогичные результаты) (см. рис. 7). И, наконец, в-третьих, отсутствие зарегистрированных в экспериментальном блоке исследования закономерностей изменения белка Bax при действии rTNFα может быть сопряжено с IL-2, усиление секреции которого отмечается при острой вирусной инфекции (Ройт А., 2000; Хаитов Р.М., 2001; 2006). Установлено, что IL-2 способен через активацию киназ МЕК1 и Аkt высвобождать Bax из комплекса с антиапоптотическими протеинами Bcl-2 и Bcl-xL и, тем самым, опосредовать пополнение пула несвязанных проапоптотических белков (Parikh N. et al., 2004).


*

*

*

*

Bcl-2

Bcl-xL

Bax

Bad

усл. ед.


Рис. 7. Уровень белков Bcl-2, Bcl-xL, Bax и Bad в лимфоцитах крови у пациентов с клещевым энцефалитом


Таким образом, подводя итог проведенного нами исследования, можно отметить, что эксперимент in vitro с использованием рекомбинантной формы TNFα продемонстрировал дозозависимый эффект цитокина на реализацию программы клеточной гибели лимфоцитов путем апоптоза и некроза. Изучение молекулярных механизмов проапоптотического действия TNFα показало, что указанный цитокин способен вызывать активацию митохондриального и Р53-опосредованного путей инициации танатогенной программы. Важнейшую роль в данных интрацеллюлярных событиях играют вторичные мессенджеры передачи сигнала – активные формы кислорода, благодаря которым осуществляется регуляция образования функциональных форм транскрипционных факторов NF-κB и Р53. Однако апоптозиндуцирующее действие TNFα во многом предопределяется Р53, стимулирующего пополнение проапоптотического белка Bad и препятствующего синтезу ингибирующих апоптоз Bcl-2 и Bcl-xL, что способствует нарушению целостности митохондриальной мембраны.

Выявленные в экспериментальном блоке исследования механизмы TNFα-индуцированного апоптоза верифицированы и в условиях in vivo при повышенной продукции цитокина. Однако их реализация обусловлена не только действием TNFα, но и наличием ряда факторов, являющихся неотъемлемой частью реакций организма и связанных как с присутствием болезнетворного агента, так и эффектами на клетку других регуляторных молекул.

Дальнейшие исследования механизмов апоптогенного действия TNFα на клетки, на наш взгляд, сопряжены с изучением влияния цитокина на регуляцию других транскрипционных факторов и в условиях изменения активности различных участников TNFα-индуцированной танатогенной программы. Полученные знания могут быть положены в основу разработки технологии коррекции патологических процессов и состояний, характеризующихся изменением продукции TNFα и модуляцией его внутриклеточной сигналпередающей системы.


ВЫВОДЫ


  1. Влияние TNFα на реализацию гибели лимфоцитов крови носит дозозависимый характер: рекомбинантный TNFα человека в диапазоне концентраций от 0,050 до 0,150 нг/мл вызывает рост числа клеток в состоянии апоптоза, при дозе 0,150 нг/мл – повышение количества лимфоцитов, претерпевающих некроз.

  2. TNFα-индуцированный апоптоз в условиях in vitro и апоптоз лимфоцитов крови у пациентов с острым клещевым энцефалитом характеризуется увеличением количества лимфоцитарных клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий и повышенным содержанием активных форм кислорода.

  3. Апоптоз лимфоцитарных клеток крови, опосредованный рекомбинантным TNFα, в условиях in vitro, а также у больных острым клещевым энцефалитом, связан с активацией транскрипционных факторов NF-kB и Р53.

  4. При культивировании лимфоцитов крови с рекомбинантным TNFα в апоптогенной концентрации (0,050 нг/мл) и в условиях повышенной продукции TNFα при остром клещевом энцефалите имеет место дисбаланс белков семейства Bcl-2, обусловленный снижением содержания антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-xL.

  5. При патологии, характеризующейся повышенной продукцией TNFα (острый клещевой энцефалит), и при действии на лимфоцитарные клетки рекомбинантной формы цитокина в конечной концентрации 0,050 нг/мл in vitro имеют место общие закономерности TNFα-опосредованного нарушения регуляции апоптоза лимфоцитов крови.


^ СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


  1. Роль цитокинов в редокс-зависимой регуляции апоптоза / О.Е. Чечина, А.К. Биктасова, Е.В. Сазонова, О.Б. Жукова, Т.С. Прохоренко, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий // Бюллетень сибирской медицины. – 2009. – №2. – С. 67-71.

  2. Роль NF-kB, P53 и Р21 в регуляции ФНОα-опосредованного апоптоза лимфоцитов / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, О.Б. Жукова, А.К. Биктасова, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова, Т.Т. Радзивил, А.Н. Вайс, Н.Ю. Часовских // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины – 2010. – №1. – С. 56-59.

  3. Роль активных форм кислорода и белков семейства Bcl-2 в реализации ФНОα-опосредованного апоптоза лимфоцитов / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, О.Б. Жукова, А.К. Биктасова, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова, М.В. Белкина, Н.Ю. Часовских, З.К. Хаитова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины – 2010. – №2. – С. 139-142.

  4. Состояние TNFα-опосредованного пути регуляции апоптоза лимфоцитов периферической крови при длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова // Науки о человеке: Материалы VII Конгресса молодых ученых и специалистов г.Томск, 17-18 мая 2007. – Томск, 2007. – С. 168.

  5. TNF-опосредованная регуляция программированной гибели лимфоцитов при антигенемии вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова, Т.С. Прохоренко, А.Н. Вайс, Н.В. Кочакова // Актуальные проблемы патофизиологии: Материалы Межгородской конференции молодых ученых– г. Санкт–Петербург, 24-25 апреля 2007. – Санкт–Петербург, 2007. – С. 13-14.

  6. Клинико-иммунологическая характеристика клещевого энцефалита / И.Н. Удинцева, О.Е. Чечина, Н.Г. Жукова, Л.В. Лукашова, Н.В. Рязанцева, А.М. Попонина, Л.А. Малышева, Н.Н. Бартфельд, З.С. Кемерова, А.К. Биктасова, Е.В. Сазонова // Медицина в Кузбассе: Материалы Межрегиональной научно-практическая конференции с международным участием «Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций» – 2008. – № 5. – С. 152-156.

  7. Молекулярные механизмы дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при дисбалансе Тh1- и Тh2-цитокинов / Н.В. Рязанцева, О.Е. Чечина, В.В. Новицкий, А.К. Биктасова, Е.В. Сазонова, Т.Т. Радзивил // Российский иммунологический журнал: Материалы Объединенного иммунологического форума – г. Санкт-Петербург, 30 июня-5 июля 2008. –2008. – Т. 2(11), №2-3. – С. 259.

  8. Дисбаланс белков семейства Bcl-2 в модуляции апоптоза лимфоцитов / А.Н. Марошкина, О.Е. Чечина, О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, Т.С. Прохоренко, А.К. Биктасова, М.В. Белкина, Е.В. Сазонова, А.П. Зима, Т.Т. Радзивил // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: Сборник статей. –Пущино, 2009. - Т.2 – С. 457-461.

  9. Дозозависимые эффекты IL-2 на программированную гибель лимфоцитарных клеток / Е.В. Сазонова, О.Е. Чечина, А.К. Биктасова, О.Б. Жукова // Актуальные проблемы патофизиологии: Материалы Межгородской конференции молодых ученых – г. Санкт–Петербург, 22-23 апреля 2009. – Санкт–Петербург, 2009. – С. 96-97.

  10. Изменение содержания транскрипционных факторов при TNFα-опосредованном апоптозе лимфоцитов крови / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, О.Е. Чечина, В.В. Новицкий // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии: Материалы Х Международного конгресса – г. казань, 20-23 мая 2009. – Казань, 2009.– С. 278.

  11. Молекулярные механизмы цитокиновой регуляции апоптоза лимфоцитов / О.Е. Чечина, А.К. Биктасова, Е.В. Сазонова, О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий // Аллергология и иммунология: Материалы VII съезда аллергологов и иммунологов СНГ – г. Санкт-Петербург, 25-28 апреля 2009. – 2009. – Т. 10, №2.- С. 176.

  12. Нарушение TNFα-опосредованного апоптоза лимфоцитов как механизм формирования хронической персистенции вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова, О.Б. Жукова // Актуальные проблемы патофизиологии: Материалы Межгородской конференции молодых ученых – г. Санкт–Петербург, 22-23 апреля 2009. – Санкт–Петербург, 2009. – С. 18-19.

  13. Роль белков семейства Bcl-2 в регуляции IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов крови / Е.В. Сазонова, А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, О.Е. Чечина, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии: Материалы Х Международного конгресса – г. казань, 20-23 мая 2009. – Казань, 2009.– С. 308.

  14. Роль p53 и NFkВ в реализации IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов / Е.В. Сазонова, О.Е. Чечина, А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, И.С. Лосенков, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий // Медицинская иммунология: Материалы XIII всероссийского форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2009» – г. Санкт-Петербург, 8-11 июня 2009. – 2009. – № 4-5. – С. 334.

  15. Система TNFα-TNF-RI и апоптоз лимфоцитов крови при хронической антигенемии вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, И.С. Лосенков // Медицинская иммунология: Материалы XIII всероссийского форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2009» – г. Санкт-Петербург, 8-11 июня 2009. – 2009. – № 4-5. – С. 380.

  16. Участие транскрипционных факторов и белков семейства Bcl-2 в TNFα-опосредованном апоптозе лимфоцитов / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова // Науки о человеке: Материалы X Конгресса молодых ученых и специалистов г. Томск, 28-29 мая 2009.– Томск, 2009.– С. 71-72.

  17. Молекулярные мишени проапоптотического действия ИЛ-2, ИЛ-4 и ФНОα при поляризации иммунного ответа по Th1- и Th2 пути / Н.В. Рязанцева, О.Е. Чечина, В.В. Новицкий, Е.В. Сазонова, А.К. Биктасова // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием г. Новосибирск, 27-29 октября 2009. – Новосибирск, 2009.– С. 226-227.

  18. P53 и NFkB – сигнальные трансдукторы IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов / Е.В. Сазонова, О.Е. Чечина, А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, И.С. Лосенков, З.К. Хаитова // Науки о человеке: Материалы X конгресса молодых ученых и специалистов г. Томск, 28-29 мая 2009. – Томск, 2009.– С. 101-102.


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ


АФК – активные формы кислорода

КЭ – клещевой энцефалит

ОКЭ – острый клещевой энцефалит

FITC – флюоресцеинизотиоцианат

IL– интерлейкин

МАР-киназы – митогенактивируемые протеинкиназы

rTNFα – рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа

TNF-RI – рецептор к фактору некроза опухоли альфа 1-го типа

TNFα – фактор некроза опухоли альфа


Соискатель Биктасова А.К.





Скачать 387,92 Kb.
Дата конвертации22.07.2013
Размер387,92 Kb.
ТипАвтореферат
Разместите кнопку на своём сайте или блоге:
rud.exdat.com


База данных защищена авторским правом ©exdat 2000-2012
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Документы