Авторское выполнение научных работ любой сложности грамотно и в срок icon

Авторское выполнение научных работ любой сложности грамотно и в срок



Смотрите также:

www.diplomrus.ru ®

Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок

ВВЕДЕНИЕ...:... 4


ГЛАВА 1. ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В СИСТЕМЕ «МИКРООРГАНИЗМЫ - ЛАКТОФЕРРИН ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА»


(обзор литературы) ... 9


1.1. Роль лактоферрина в гомеостазе организма человека... 9


1.2. Антимикробное действие лактоферрина... 12


1.3. Адаптация микроорганизмов к действию лактоферрина... 32


ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ... 37


2.1. Характеристика культур микроорганизмов... 37


2.2. Выделение и идентификация микроорганизмов... 38


2.3. Методы изучения биологических свойств микроорганизмов ... 40


2.3.1. Определение протеолитической активности 40 микроорганизмов...


2.3.2. Определение факторов персистенции микроорганизмов ... 41


2.4. Методы воспроизведения экспериментальной инфекции... 43


2.4.1. Метод воспроизведения стафилококковой экспериментальной инфекции... 43


2.4.2. Метод воспроизведения интратрахеального заражения


крыс... 45


2.5. Методы гистологической обработки материала... 46


2.6. Приготовление копрофильтратов и определение в них 46 концентрации лактоферрина...


2.7. Статистическая обработка результатов... 47


^ ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИ-ЛАКТОФЕРРИНОВОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ... 48


3


ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИЛАКТОФЕРРИНОВОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ... 58


4.1. Распространенность и выраженность антилактоферриновой активности микроорганизмов... 58


4.2. Связь антилактоферриновой активности микроорганизмов с другими биологическими характеристиками... 66


^ ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ РОЛИ АНТИЛАКТОФЕРРИНОВОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИМОВ... 70


5.1. Роль антилактоферриновой активности микроорганизмов в развитии экспериментального инфекционного процесса ... 70


5.2. Морфо-функциональная характеристика тканей макроорганизма при экспериментальной инфекции... 81


5.3. Использование показателя антилактоферриновой активности микроорганизмов в клинико-лабораторной практике... 92


ЗАКЛЮЧЕНИЕ... 96


ВЫВОДЫ... 104


^ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ... 106


ПРИЛОЖЕНИЯ... 134

Введение


4 ВВЕДЕНИЕ


Актуальность проблемы


Лактоферрин - железосвязывающий гликопротеин из семейства транс-ферринов, участвующий в ряде гомеостатических функций организма человека. С начальных этапов изучения лактоферрина не было сомнений в том, что он играет определенную роль в неспецифической защите организма, оказывая как бактериостатическое, так и бактерицидное действие на микроорганизмы. Антимикробное действие лактоферрин оказывает на грамположительные и гра-мотрицательные бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, вирусы. Подробно описаны механизмы антимикробного действия лактоферрина: способность конкурировать с микроорганизмами за ионы железа в среде [182], взаимодействие с клеточной стенкой микроорганизмов, которое приводит к нарушению транспортной функции мембраны [147, 175], протеолитическое расщепление некоторых факторов вирулентности микроорганизмов [132, 203, 133], образование активных производных - лактоферрицинов и лактоферрампина [74, 157]; стимуляция фагоцитоза [181].


В настоящее время известно, что микроорганизмы способны подавлять многие факторы естественной резистентности организма хозяина, такие как ли-зоцим, комплемент, гистоноподобные белки, катионный белок тромбоцитов [10]. Наличие факторов персистенции обеспечивает бактериям длительное нахождение в макроорганизме. Разработка методических приемов микробиологического тестирования персистентного потенциала бактерий позволяет повысить качество диагностики и терапии инфекционных заболеваний.


В то же время, вопрос об адаптации микроорганизмов к антимикробному действию лактоферрина остается в значительной степени не изученным.


Цель и задачи исследования


Целью настоящего исследования явилось определение способности микроорганизмов к инактивации лактоферрина и оценка биологической роли этого признака.


Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:


1. Разработать метод определения антилактоферриновой активности микроорганизмов.


2. Определить распространенность и выраженность антилактоферриновой активности у микроорганизмов различных групп.


3. Оценить биологическую роль антилактоферриновой активности микроорганизмов.


Научная новизна


Разработан метод определения антилактоферриновой активности (АЛфА) микроорганизмов, основанный на определении остаточного количества лактоферрина в инкубационной смеси с помощью иммуноферментного анализа (патент РФ на изобретение № 2245923). Данный метод позволяет количественно определять АЛфА у широкого круга микроорганизмов, характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, сокращает время исследования.


С помощью разработанного метода определена антилактоферриновая активность у стафилококков, стрептококков, энтеробактерий, франциселл, дрож-жеподобных грибов, выделенных из различных биотопов организма человека в норме и при инфекционных заболеваниях. Более половины (60-80%) исследуемых культур микроорганизмов обладали способностью инактивировать лакто-феррин. Установлено, что выраженность и распространенность АЛфА зависит от источника выделения микроорганизмов и формы инфекционного процесса. Высокие значения АЛфА бактерий были выявлены у культур, изолированных


6


из биотопов с высоким содержанием лактоферрина (репродуктивный тракт), а также при хронических воспалительных заболеваниях и от бактерионосителей.


На модели экспериментальной стафилококковой инфекции определена роль антилактоферринового признака бактерий в феномене их персистенции - длительного переживания возбудителя в организме хозяина. При инфицировании лабораторных животных изогенными клонами Staphylococcus aureus, отличающимися по АЛфА, отмечены более длительные сроки бактериовыделения стафилококков, обладающих данной активностью. Отмечено, что клон с АЛфА вызывает деструктивные изменения в почечной ткани мышей. Определены особенности взаимодействия клонов кишечной палочки, обладающих разным уровнем АЛфА, с клетками организма хозяина. Показано, что микроорганизмы с антилактоферриновой активностью подавляют регенераторные потенции тканей макроорганизма, вызывают деструктивные изменения, что характеризует антилактоферриновый признак как «малый» фактор патогенности.


Выявлено, что система «лактоферрин хозяина - антилактоферриновая активность микроорганизмов» имеет диагностическое значение и может быть использована для прогнозирования бактерионосительства. Высокий уровень АЛфА сальмонелл и сниженная концентрация лактоферрина в кишечнике в разгар заболевания обуславливают развитие реконвалесцентного сальмонеллезного бактерионосительства (патент РФ № 2242756).


Научно-практическая ценность


Полученные данные расширяют теоретические представления о биологических свойствах патогенных и условно-патогенных бактерий, способствуют расшифровке патогенеза инфекционных заболеваний, что используется в процессе преподавания раздела «Инфекция и иммунитет» курса медицинской микробиологии Оренбургской государственной медицинской академии.


Практическое значение исследований определяется разработкой метода изучения одного из факторов персистенции микроорганизмов - антилактоферриновой активности. Исследование у культур микроорганизмов персистентного


7 потенциала позволяет прогнозировать переход болезни в хроническую форму, а


также возникновение бактерионосительства.


Разработанный метод также может быть использован для прогнозирова-^ ния течения инфекционного процесса (в частности, прогнозирования реконва-


I лесцентного сальмонеллезного бактерионосительства), оценки эффективности


терапии гнойно-воспалительных заболеваний.


Полученные материалы использованы в методических рекомендациях МЗ РФ «Прогнозирование тяжести течения и местное лечение острых ограниченных гнойно-воспалительных заболеваний легких и плевры» (Оренбург, 2004).


Положения, выносимые на защиту


1. Антилактоферриновая активность микроорганизмов широко распространена среди бактерий и грибов различных групп, определяя их адаптацию к многофакторному антимикробному действию лактоферрина.


2. Антилактоферриновая активность микроорганизмов является одним из (. факторов персистенции бактерий, способствующим выживанию в организме хозяина.


Апробация работы


Материалы диссертации были доложены и обсуждены на:


- региональной конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 2001; 2003; 2005);


- I Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003);


IV Всероссийской конференции по персистенции микроорганизмов 5 (Оренбург, 2003);


f - Всероссийской конференции «Здоровое питание населения России»


(- (Москва, 2003);


8


- научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей» (Санкт-Петербург, 2004);


- научно-практической конференции по медицинской микологии (VII Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2004);


- VII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2005). Диссертационное исследование является фрагментом научно-исследовательской работы, проводимой в рамках программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (проект «Разработка новых подходов к диагностике и терапии дисбиозов и ассоциированной с ними инфекционно-воспалительной патологии»), проекта «Антилак-тоферриновая активность микроорганизмов» (грант РФФИ № 04-04-96162) и темы «Изучение симбиотических взаимоотношений в микробиоценозах тела человека» (№ гос. регистрации 01.2.00 104756).


Публикации


По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе: 3 публикации в рецензируемых научных журналах, 2 патента РФ на изобретение, пособие для врачей МЗ РФ.


Объем и структура диссертационной работы


Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы, приложения. Указатель литературы содержит 262 источника литературы, из которых 62 отечественных и 200 зарубежных. Текст иллюстрирован 12 таблицами и 24 рисунками. Дис- сертация содержит 6 приложений.


9


^ ГЛАВА 1. ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В СИСТЕМЕ «МИКРООРГАНИЗМЫ - ЛАКТОФЕРРИН ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА»


(обзор литературы)


1.1. Роль лактоферрина в гомеостазе организма человека


Лактоферрин (ЛФ) - железосвязывающий гликопротеин из семейства трансферринов. Впервые лактоферрин был обнаружен в коровьем молоке в 1939 году Sorensen и Sorensen [227], изолирован Crokes и описан как «красный белок» молока коров. Из молока человека лактоферрин был выделен в 1960 году. На данный момент известно, что ЛФ содержится в большинстве экзокрин-ных секретов, а также во вторичных гранулах зрелых нейтрофилов.


Лактоферрин обнаруживают и в тканях животных. К настоящему времени изолирован и исследован лактоферрин молока различных млекопитающих: коров [221], коз, кобыл [222], обезьян, мышей [180], кроликов, свиноматок


ЛФ представляет собой мономерный гликопротеин с молекулярной массой 75 700 ± 500 Да, относится к (3-глобулинам [62]. В его составе около 692 аминокислотных остатков [42]. Лактоферрин по своему строению сходен с другими белками семейства трансферрина. ЛФ содержит 3% гексоз и 1% гексоза-мина, особенно богат маннозой; относится к щелочным белкам, его изоэлек-трическая точка составляет 8,7 [25].


Этот гликопротеин состоит из двух шаровидных долей, N и С. Доли делятся на два домена, N1 и N2, а также С1 и С2. Железосвязывающий сайт расположен между доменами в каждой доле [223]. Молекула лактоферрина связывает два Fe3+ и два Си2+ иона с высоким сродством, причем сродство данного белка к железу в 260 раз выше, чем сродство трансферрина [129]. В центрах связывания, расположенных в каждой из двух долей, железо координационно связано с двумя остатками тирозина, одним - гистидина и одним -аспарагиновой кислоты [25]. Лактоферрин также способен связывать ионы других металлов.


Железосвязывающая способность обуславливает участие ЛФ в обмене железа в организме человека [8]. ЛФ является регулятором концентрации сво-


10


бодных ионов железа в крови и секретах [42]. Показано участие ЛФ в регуляции абсорбции железа в желудочно-кишечном тракте новорожденных в качестве ограничительного фактора абсорбции [97]. Эксперименты in vitro показали, что лактоферрин способен отдавать железо энтероцитам. Участие лактоферрина в абсорбции железа в кишечнике было подтверждено после обнаружения специфических рецепторов к гликопротеину на поверхности щеточной мембраны энтероцитов [107, 217].


До недавнего времени считалось, что ЛФ синтезируется только клетками железистого эпителия, поскольку он регулярно выявлялся в секретах и не был обнаружен в сыворотке. Однако сейчас доказано, что ЛФ содержится и в клетках гемопоэтической ткани (в костном мозге, селезенке, лимфатических узлах) на стадии промиелоцитов и его количество увеличивается в нейтрофильных лейкоцитах по мере их созревания.


Лактоферрин обнаружен в тимусе, секретируется многими эпителиальными клетками, содержится в молоке [32], слюне, бронхиальном секрете [16, 234], слезной жидкости, ликворе, желчи, соке поджелудочной железы, синовиальной жидкости, моче, сперме, цервикальной слизи и других биологических жидкостях организма [23, 186]. Особенно много лактоферрина в женском молоке. Его концентрация зависит от срока лактации [12]. Гистохимически лактоферрин обнаружен во вторичных гранулах зрелых нейтрофилов. Такие специфические гранулы нейтрофилов являются основным источником лактоферрина в сыворотке крови [126]. Концентрация лактоферрина по данным исследователей в различных средах организма представлена в таблице 1.


Показано, что концентрация лактоферрина в сыворотке крови возрастает при инфекционных заболеваниях [22, 118, 146], значительно увеличивается уровень лактоферрина в очаге воспаления [137, 164, 214, 245, 255], в опухолевых тканях [28, 51, 218].


и


Таблица 1. Концентрация лактоферрина в тканях организма человека


Среда Концентрация Автор


Сыворотка крови мужчин женщин (2,02±0,3) хЮ3 нг/мл (0,62±0,10)х103нг/мл 1112+191 нг/мл (0,44+0,10)хЮ3 нг/мл 993±55 нг/мл Меркулов А. Г.. и др., 989 Конышева Т. В. и др., 1998 Сухарев А. Е. и др., 1990 Конышева Т. В. и др., 1998 Сухарев А. Е. и др., 1990


Плазма крови 0,1-0,4x103 нг/мл Henric S., 1984


Вагинальная слизь - накануне менструаций - после менструаций 1,0x106 нг/мл 3,87-11,4 нг/мкг белка 62,9-218,0 нг/мкг белка Герман Г. П. и др., 1983 S. Myron et al., 1987 S. Myron et al., 1987


Спинномозговая жидкость (0,005±0,002)х103 нг/мл Конышева Т. В. и др., 1998


Моча 60 нг/мл Конышева Т. В. и др., 1998


Мокрота 0,8-2,5 х106 нг/мл Biserte et al., 1963


Зрелое женское молоко 1-3 х106 нг/мл Вельтищев Ю. Е., 1991


Коровье молоко 20-200x103 нг/мл Вельтищев Ю. Е., 1991


Молозиво 7,0 -15,0хЮ6 нг/мл Герман Г. П. и др., 1983


Слезная жидкость 1хЮ5 нг/мл Герман Г. П. и др., 1983


Носовой секрет 1хЮ5 нг/мл Герман Г. П. и др., 1983


Содержимое панкреатических кист 1x105 нг/мл Герман Г. П. и др., 1983


Слюна 1x104 нг/мл Герман Г. П. и др., 1983


Околоплодные воды рожениц (4,25±0,50)х103 нг/мл Конышева Т. В. и др., 1998


Копрофильтрат 180±45,0 нг/мл Чайникова И. Н. и др., 2000


12


Функции ЛФ в организме человека многообразны [18, 169, 173]. Помимо участия в обмене железа, данный гликопротеин регулирует гемопоэз по принципу обратной связи, мономерная форма ЛФ может влиять на гранулоцитопоэз подавляя выброс моноцитами простагландинов группы Е [86]. Противовоспа- лительная активность лактоферрина обусловлена способностью блокировать образование СЗ-конвертазы, что приводит к ингибированию классического пу-ти активации системы комплемента. Вследствие этого снижается образование анафилатоксинов СЗа и С5а и уменьшается воспалительная реакция [156]. Получены данные, что железоненасыщенный лактоферрин ингибирует выброс гистамина [242].


В эксперименте in vivo показано, что лактоферрин и его производное -лактоферрицин способны ингибировать развитие метастаз у экспериментальных животных [95,131].


Установлено, что лактоферрин способствует росту эпителиальных клеток кишечника, и возможно, играет роль в созревании кишечника у новорожденных [179].


Ряд биологических свойств ЛФ позволяют отнести его к факторам неспецифической защиты организма.


1.2 Антимикробное действие лактоферрина


ЛФ способен оказывать бактерицидное и бактериостатическое действие на микроорганизмы. Впервые антибактериальное действие лактоферрина продемонстрировали Masson и Heremans [182]. В настоящее время известно о широком антимикробном спектре лактоферрина (табл. 2).


Первоначально считалось, что в основе антимикробной (микробостатиче- ской) функции белка лежит способность ненасыщенного железом лактоферри- на (аполактоферрин) связывать и транспортировать катионы металлов пере- менной валентности. Создавая и поддерживая дефицитную по катионам железа и других металлов среду, ЛФ является одним из ведущих молекулярных меха-низмов, сдерживающих размножение и рост бактерий и низших грибов на по-


13 верхности эпителиальных клеток и в условиях фаголизосом нейтрофильных


гранулоцитов [182]. Насыщенный железом лактоферрин (гололактоферрин) не способен ингибировать рост микроорганизмов [110].


В последующем было обнаружено, что ЛФ может связываться с поверх-


I ностью бактерии, нарушая транспортную функцию клеточной мембраны. Ан-


тимикробная активность лактоферрина в отношении Е. coli обусловлена непо-средственным контактом между белком и микробной оболочкой [147]. ЛФ способен связываться с поверхностными структурами бактериальной клетки, доказательством чему служит рост культуры Е. coli при избытке или дефиците железа. Показано, что у Е. coli имеются два связываемых лактоферрином сайта липополисахарида, один из которых имеет высокое сродство, а другой - низкое к лактоферрину человека [175]. Shin К. с соавторами (1998) установили, что лактоферрин и его производные подавляют рост и развитие штаммов энтероге-моррагических кишечных палочек, взаимодействуя с поверхностью бактери-альной клетки [69].


В тоже время, ЛФ может связываться с поринами мембраны бактерий [204]. Установлено, что бактерицидная активность ЛФ обусловлена его способностью связываться с поринами, от которых зависит устойчивость и проницаемость клеточной мембраны. Гликопротеин связывается с белками ОтрС и PhoE и, соответственно, со штаммами Е. coli, содержащими эти порины. При этом рост микроорганизмов, содержащих PhoE, полностью подавляется. Минимальная подавляющая концентрация (МПК) лактоферрина составила 2,4 мг/мл.


Поиск активного домена в молекуле лактоферрина выявил, что антимикробная последовательность расположена в N-доле и представлена главным об-


* разом петлей из 18 аминокислотных остатков, образованной дисульфидной свя-


j зью между остатками цистеина 20 и 37 (лактоферрин человека) или 19 и 36


> (лактоферрин коров) [64, 70, 74].


14


Спектр антимикробного действия лактоферрина


Таблица 2.


Группа, вид микроорганизма Автор


Грамположительные бактерии


Actinomyces viscosus Sandberg A.L. et al., 1988


Bacillus cereus Custer M.C. et al., 1983


Bifidobacterium bifidus var. pennsylvanicus Bezkorovainy A. et al., 1981


Clostridium ramosum TeraguchiS. etal., 1995


Clostridium paraputrificum Teraguchi S. et al., 1995


Clostridium perfringens TeraguchiS. etal., 1995


Enterococcus faecalis LeitchE.C. etal., 2001


Enterococcus faecium LeitchE.C. etal., 2001


Listeria monocytogenes Longhi С et al., 2004


Micrococcus luteus Perraudin J. P. et al., 1980


Mycobacterium avium Silva MT. et al., 1989


Mycobacterium bovis Silva MT. et al., 1989


Mycobacterium microti Silva MT. et al., 1989


Mycobacterium kansasii Silva MT. etal., 1989


Staphylococcus aureus Bhimani R. S. et al., 1999


Staphylococcus epidermidis Leitch E. С et al., 1999


Streptococcus mutans Lassiter M. O. et al., 1987


Грамотрицательные бактерии


Enterobacter aerogenes Bishop J. G., 1976


Escherichia coli Zagulski T. et al., 1989


Actinobacillus actinomycetemcomi-tans Kalmar J.R. et al., 1988


Haemophilus influenzae Plaut A.G. et al., 2000


Legionella pneumophila Bortner C.A. et al., 1986


Helicobacter pylori WadaT. etal., 1999


Helicobacter felis Dial E. J. et al., 1998


Klebsiella pneumoniae Oliver S. P. et al., 1987


Porphyromonas gingivalis Aguilera O. et al., 1998


Prevotella intermedia Aguilera O. et al., 1998


Prevotella nigrescens Aguilera O. et al., 1998


Pseudomonas aeruginosa Butrus S. I. et al., 1987


Salmonella typhimurium Naidu S. S. et al., 1993


Salmonella montevideo Yamauchi K. et al., 1993


Salmonella typhimurium Yamauchi K. et al., 1993


Shigella sonnei Денисова И. И. и др., 1996


Vibrio cholerae Arnold R. R. et al., 1977


Yersinia pseudotuberculosis Salamah A. A. et al., 1995


15


Продолжение табл. 2.


Спирохеты


Treponema denticola Hurlen В. et al., 1984


Грибы


Aspergillus sp. Abe S. et al., 2000


Blastomyces dermatitidis Giles S. et al., 2002


Candida albicans Muller F. M. et al., 1999, Andersson Y. et al., 2000; XuY.Y.etal., 1999


Candida glabrata Xu Y.Y. et al., 1999


Candida guilliermondii Xu Y.Y. et al., 1999


Candida krusei Samaranayake Y.H. et al., 1997; XuY.Y.etal., 1999


Candida parapsilosis XuY.Y.etal., 1999


Candida tropicalis XuY.Y.etal., 1999


Rhodotorula rubra Andersson Y. et al., 2000


Trichophyton mbrum Yamauchi K. et al., 2000


Trichophyton mentagrophytes Yamauchi K. et al., 2000


Простейшие


Entamoeba histolytica Murray M.J. et al., 1980


Giardia lamblia Turchany J. M. et al., 1997


Plasmodium falciparum EdaS. etal., 1999


Pneumocystis carinii Cirioni O. et al., 2000


Toxoplasma gondii Tanaka T. et al., 1995, 1996


Вирусы


Вирус простого герпеса Hasegawa K. et al., 1994; Fujihara T. et al., 1995;


Полиовирус Marchetti M. et al., 1999


Ротавирус Superti F. et al., 1997


Вирусы иммунодефицита человека (ВИЧ-1,ВИЧ-2) Swart P.J. et al., 1996 Harmsen M.C. et al., 1995 Puddu P. et al., 1998


Цитомегаловирус Harmsen M.C. et al., 1995; Portelli J. et al., 1998; Clarke N.M. et al., 2000


Респираторно-ситнтициальный вирус Portelli J. et al., 1998


Вирус гепатита С Ikeda M. et al., 1998, 2000


Хантавирус Murphy M.E. et al., 2000


16


При определенных условиях из ЛФ образуются пептиды с выраженной антимикробной активностью, действие которых не связано с захватом и удержанием железа [74, 96, 102, 128, 130, 136, 155, 199, 247, 262]. В ряде случаев микробоцидное действие лактоферрина in vivo можно объяснить влиянием этих метаболитов. В настоящее время получены и синтетические аналоги пептидов -производных лактоферрина, обладающие антимикробной активностью [231].


В 1991 г. Н. Saito с соавторами в ходе высокотемпературного кислотного гидролиза лактоферрина крупного рогатого скота получили продукт, который обладал антибактериальной активностью в концентрации 10 мкг/мл в культу-ральной среде [207]. Гидролизат лактоферрина коров, полученный при прогревании последнего при 120°С в течение 15 мин и рН 2,0 (степень гидролиза около 10%), не имел железосвязывающей способности (0%) и обладал низкой антигенностью (около 10"6) по сравнению с нативным ЛФ.


В другой серии экспериментов было показано, что гидролизаты, получен-ные при расщеплении лактоферрина свиным пепсином, пепсином трески или кислой протеазой из Penicillium duponti, проявляли выраженное действие в отношении Escherichia coli 0111 (значительно меньшая активность гидролизатов была отмечена при обработке трипсином, папаином или другими нейтральными протеазами). Низкомолекулярные пептиды, образовавшиеся при расщеплении лактоферрина свиным пепсином, обладали широким спектром действия, подавляя рост целого ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, включая штаммы, которые были устойчивы к нативному лактофер-рину. Антибактериальная активность гидролизата была по меньшей мере в 8 раз выше, чем у нативного лактоферрина, и сохранялась при добавлении железа [206].


При переваривании желудочным пепсином из лактоферрина коров образу- ется лактоферрицин В (рис. 1). Активный центр лактоферрицина В состоит из шести остатков (RRWQWR-NH2) [220]. Изучена структура данного пептида [244]. Совсем недавно Е. W. Odell с соавторами (1996) показали, что лакто-феррин человека содержит последовательность из 46 аминокислотных остат-


17


ков, названную лактоферрицином Н, которая связана с антимикробными свойствами лактоферрина. Синтетические пептиды HLT1, соответствующий петлевому участку лактоферрина человека (FQWQR-NMRKVRGPPVS) и HLT2, соответствующий его заряженной части (FQWQRNMRKVR), проявляли значительную антибактериальную активность в отношении штаммов Е. coli 0111 NCTC 8007 и ML35. Сходство последовательностей между лактоферрицином, дермасептином и магайнинами позволило авторам предположить, что лакто-феррицин может действовать как амфипатическая альфа-спираль [72].


Рисунок 1.


Ленточная диаграмма домена N1 коровьего лактоферрина: антимикробные пептиды лактоферрицин и лактоферрампин [van der Kraan M. I. et al., 2004]


Лактоферрампин (268-284)


Лактоферрицин (17-41)


r

Список литературы



Скачать 156,74 Kb.
Дата конвертации19.08.2013
Размер156,74 Kb.
ТипДокументы
Разместите кнопку на своём сайте или блоге:
rud.exdat.com


База данных защищена авторским правом ©exdat 2000-2012
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Документы