Всероссийской научно-практической конференции 25 апреля 2012 года Бийск Издательство Алтайского государственного технического университета им. И. И. Ползунова 2012 icon

Всероссийской научно-практической конференции 25 апреля 2012 года Бийск Издательство Алтайского государственного технического университета им. И. И. Ползунова 2012



Смотрите также:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   ...   16
^

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТОВ В ЭКСТРАКТАХ МУЖСКИХ ПОЧЕК ОБЛЕПИХИ КРУШИНОВИДНОЙ




23.О.М. Мельников, А.Л. Верещагин

24.Бийский технологический институт АлтГТУ, г. Бийск



Введение. Известно, что свободные радикалы участвуют в патогенезе многих заболеваний. Атеросклероз  основная патология большинства серьезных сердечнососудистых заболеваний. Причины его возникновения окончательно не выяснены, но считается, что одна из них  это перекисное окисление липидов сосудистого эндотелия свободными радикалами [1].

Свободный радикал NO (монооксид азота) играет важную роль во многих физиологических процессах. В частности, он расширяет сосуды, переносит сигналы в центральной и периферической нервной системах и участвует в цитотоксической и цитостатической реакциях иммунной системы [2]. Выяснено, что клетки почти всех изученных до сих пор типов способны синтезировать NO с помощью трех различных NO-синтаз. Считается, что избыточный и нерегулируемый (патофизиологический) синтез NO может вызывать у людей множество болезней, приводящих к смерти или нетрудоспособности [3]. Токсичность NO, по-видимому, во многом обусловлена образованием высокотоксичного пероксинитрита ONOO- (рК 6.8), который образуется в результате быстрой рекомбинации NO и супероксидного анион-радикала 02 [4]. При физиологических значениях рН примерно половина пероксинитрита находится в протенированной форме в виде пероксиазотистой кислоты HOONO. В мономолекулярной реакции последняя довольно быстро (время полупревращения ~ 1-2 с) изомеризуется в нитрат, однако параллельно она распадается на свободные радикалы с выходом около 30 % [4]. В организме пероксиазотистая кислота и анион пероксинитрита могут реагировать со многими соединениями по бимолекулярному механизму.

Клетки защищаются от повреждений, вызываемых окислителями, с помощью ряда механизмов [1]. Такие ферменты, как супероксиддисмутаза и каталаза, каталитически обезвреживают реакционные кислородсодержащие свободные радикалы. Некоторые белки (например, трансферрин, церулоплазмин и альбумин) образуют комплексы с ионами переходных металлов и тем самым уменьшают каталитическую активность этих ионов в реакциях образования свободных радикалов. Присутствие в клетках антиоксидантов обеспечивает еще один очень важный защитный механизм: антиоксиданты быстро реагируют со свободными радикалами и, жертвуя собой, предохраняют более важные элементы клетки от повреждений. Основными антиоксидантами являются витамины С и Е, а также полифенолы, например флавоноиды, которые поступают в организм с пищей.

^ Экспериментальная часть. Материалы и реактивы. В работе использовали без дополнительной очистки: Пирогалловый красный (ПГК) (пирогаллосульфонфталеин Аldrich,) аскорбиновая кислота, азотная кислот, перекись водорода, нитрит натрия, этанол,

^ Приготовление пироксинитрита. Пероксинитрит получен по следующей методике. Холодные растворы (+ 3 до + 5 ºС) растворы нитрита натрия и перекиси водорода концентрацией 1,2 М смешаны с добавлением необходимого количества натра едкого для получения конечной концентрации в суммарном растворе 0,1 – 0,5 % NaOH. Перекись водорода при приготовлении закислялась азотной кислотой (из расчета 1 мл (к) H2NO3на 100 мл раствора Н2О2).

Смешение проводилось на ледяной бане раствор NаCL с температурой ниже 0 ºС при перемешивании. Через 10 минут раствор пропускался через фильтр Шота или Бюхнера сквозь слой МnО2 при незначительном вакууме. Операция повторяется 2  3 раза до прекращения интенсивного выделения газа (каталитическое разложение не прореагировавшей перекиси водорода).

Степень полноты реакции можно проконтролировать с помощью спектра поглощении раствора. Не должно быть максимума в области поглощения нитрита, и должен наблюдаться четкий максимум в области 302 нм соответствующий пироксинитриту.

Полученный раствор замораживается при температуре – 22 ºС. При заморозки снимается верхний замерзающий последним слой раствора. В дальнейшем этот слой используется как исходный концентрированный раствор пироксинитрита.

^ Приготовление пирогаллолового красного. ПГК готовится разведением в 30 мМ калий фосфатном буфере (0,03 М К2НРО4) рН 7,0 ± 0,05. В работе использовались концентрации порядка 40 – 60 мкМ.

^ Приготовление растворов антиоксидантов. Аскорбиновая кислота растворялась непосредственно в буфере. Водные и водно-спиртовые экстракты мужских почек облепихи крушиновидной готовились следующим образом. Воздушно сухое сырьё измельчалось мелкодисперсного порошкообразного состояния, заливалось экстрагентом (вода либо 40 % водный этанол), экстракция происходила в ультразвуковой ванне при температуре 35 ºС. Экстракция повторялась трижды, экстракты обеднялись. Водно-спиртовый экстракт вымораживался для удаления воскоподобных веществ.

^ Ход работы. Этот метод основан на обесцвечивании ПГК радикалами, образующимися при распаде пероксинитрита [5]. ПГК удобен для спектрофотометрического измерения его концентрации. Если к ПГК добавить антиоксидант, то он перехватит часть радикалов и таким образом частично защитит ПГК от обесцвечивания. В пробирку помещали 4 мл раствора ПГК (с концентрацией 40-60 мкМ в фосфатном буфере) либо вместе с исследуемым антиоксидантом (А), либо без него. Затем пробирку наклоняли и на ее сухую стенку с помощью микропипетки помещали 10 мкл раствора пероксинитрита (3-5 мкМ). Пробирку закрывали резиновой пробкой и быстро встряхивали. Таким образом последовательно прибавляли 5-7 порций пероксинитрита. Спектры раствора регистрировали после каждого прибавления пероксинитрита, а расход ПГК измеряли при 542 нм (е = 2.4 х 104 л моль-1 см-1).

Рассчитывали концентрацию ПГК в растворе для каждой стадии и строили график зависимости убыли концентрации ПГК от количества прибавленного пероксинитрита.





^ Выводы и обсуждение результатов. На графике видно что присутствие антиоксидантов при первом добавление пероксинитрита позволяет практически не затрачивать ПГК, таким образом максимально проявляет свои защитные функции в этот момент аскорбиновая кислота.

Характер изменения наклона кривых свидетельствует о сложности протекающих процессов имеющих по всей видимости множество стадий, сопровождающихся расходованием различных веществ. Косвенно это подтверждается «простым» наклоном кривой аскорбиновой кислоты.

Как видно, на графике водно-спиртовый экстракт обладает большей способностью защитить ПГК от обесцвечивания, на наш взгляд это связано с его более богатым составам [6], присутствие этанола в качестве экстрагента позволяет в большей мере перейти в раствор различным антиоксидантам в частности полифенолам.

Опробован простой и мало затратный метод исследования антиокислительной активности экстрактов и водорастворимых веществ.


Литература


1. Halliwell B.,Gutteridge JМ.С. Free Radicals in Biology and Medicine. 2 ed. Oxford: Clarendon Press, 1989.

2. Furchqott R. II Angew. Chem., Int. Ed. 1999. V. 38. P. 1870-1880.

3. Gross S.S., Wolin M.S. II Annu. Rev. Phys. 1995. V. 57. P. 737-769.

4. Radi R., Pehtffo G., Alvarez M.N., Navilia M., CayotaA.H. Free Radical Biol. Med. 2001. V. 30. P. 463-488.

5. Balavoine G.G.A., Geletii Yu.V. II Nitric Oxide: Biol. Chem. 1999. V. 3. P. 40-54.

6. Мельников, О.М., Верещагин, А.Л. Исследование биологически активных соединений почек и листьев облепихи крушиновидной. II Химия растительного сырья. 2010. – № 2. – С. 113-116.





страница7/16
Дата конвертации24.10.2013
Размер2,05 Mb.
ТипДокументы
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   ...   16
Разместите кнопку на своём сайте или блоге:
rud.exdat.com


База данных защищена авторским правом ©exdat 2000-2012
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Документы